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在构建基因表达载体时要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。

基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心 。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在 ，并且可以遗传给下一代
，同时，使目的基因能够表达和发挥作用
。

过程：

首先要用一定的限制酶切割质粒 ，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同

一种限制酶切断目的基因
，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果） 。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处 ，首先碱基互补配对结合
，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键 ，再加入适量DNA连接酶
，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来 ，形成一个重组DNA分子
。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合
，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。

高中生物选修3复习内容 。

1. 生物选修三知识点小测(生物选修三必考知识点~~~完整点的)

生物选修三知识点小测(生物选修三必考知识点~~~完整点的) 1.生物选修三必考知识点~~~ 完整点的

基因工程知识点扫瞄一、1 、基因工程的工具限制酶的主要来源是 作用特点是 2
、DNA连接酶主要有两类，一类来自  ，可以用来连接 
。

另一类来自 可以用来连接 。DNA连接酶的作用是：  。

3、因工程的步骤主要有 
， ，  ， ，其中用到限制性核酸内切酶是第 步
，这四个步骤中，核心是第 。4 、PCR技术是原理是 ，进行PCR的前提条件是有一段已知目的基因的 用来合成
。

PCR技术的原料是 
，模板是 ，所用酶有  ，使DNA双链解开所采用的方法是： 。因为PCR技术是一个DNA分子连续复制的过程
，所以DNA分子的数量呈 增长，即一个DNA复习n次后 ，会得到 个子代DNA 。

5、质粒是一段 DNA分子
，其结构简单，没有蛋白质作为载体 ，质粒做为基因工程的载体
，能在受体细胞中保存和复制，其上必须有一个或多个  ，并且要有 基因，以便于重组DNA的选择和鉴定
。6
、基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段
，导入 的群体中克隆和储存，从而获得大量目的基因为转基因作准备 ，如果基因文库含有某种生物所有基因
，则叫 文库，如果基因文库含有某种生物部分基因 ，则叫 文库
，如用mRNA通过 而获得的cDNA文库。

用cDNA文库中分离出的目的基因构建表达载体时，必须加上  ，否则不能在受体细胞中表达 。7、目的基因要导入受体细胞必须与运载体结合
，构建成 ，目的基因与运载体结合时 ，要用 切割
，从而目使的基因与运载体产生相同的 ，再用 连接 和 之间的磷酸二酯键
。

8 、将目的基因导入植物细胞常用的方法有  ， ， 。若导入双子叶植物和裸子植物常用
，导入单植物常用  。

9
、当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的 化合物 ，吸引农杆菌移向这些细胞
，这时农杆菌的 质粒的 片段会移到受体细胞，并整合到受体细胞的 上
。因此 ，转基因植物学用农杆菌的质粒做为运载体
，迄今为止，80%的转基因植物都是用这种方法获得的。

10、转基因植物常用的受体细胞可以是正常体细胞 ，转基因成功后通过 将其培养成转基因植株 。转基因动物经常用 做为受体细胞
，因为动物细胞的 受到限制
。

转基因动物常用的导入方法是 ，即将含有目的基因的 提纯 ，然后用显微注射仪注射进动物的 细胞
，再经 一段时间后，移植到 性动物的  ，使其发育成新个体。二 、目的基因的检测与鉴定，1
、检测目的基因是否插入染色体DNA上
，采用 技术，此方法需要用 标记目的基因 ，以此做为 
，与基因驵DNA杂交 。

2、检测的基因是否转录出了mRNA，采用 技术。3 、检测的基因是否翻译出了蛋白质 ，采用 技术
。

4
、有时
，还需要进行 水平的鉴定三、基因工程应用1 、乳腺生物反应器是将药用蛋白基因与乳腺蛋白质的 重组在一起，然后导入 性哺乳动物的  ，然后送入母体内发育成个体
，转基因动物达到泌乳期，可以从动物的乳汁中提取药物。原理相同的还有膀胱生物反应器 。

2
、转基因动物还可以作为人提供器官移植的供体 ，哺乳动物中与人内脏构造和大小最为相似的是 
，但其器官移植给人同样会有排斥反应，因此移植前应该对其进行基因工程改造 ，设法除去 ，或抑制其表达
，再结合 技术，培养出没有免疫排斥反应的转基因动物
。3、早期的基因工程经常用原核生物作为受体细胞 ，这是因为原核生物具有  、、的特点。

其中大肠杆菌是最常用的受体菌
，大肠杆菌是最常用的转化方法是：首先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中 的生理状态 ，称为 细胞
，第二步是将重组表达载体溶于 与其混合，在一定的 下 ，促进细胞吸收DNA分子
，完写成转化过程 。4
、基因治疗是治疗人类遗传病的最有效手段，基因治疗是把 导入病人体内 ，使其表达产物发挥功能
，从而达到治疗目的
。

从人体内提取某种细胞，进行培养 ，在体外进行转基因，然后再重新输入患者体内
，这叫 基因治疗。直接向人体组织细胞中转入基因的方法叫 基因治疗 。

这两种方法更可靠的是 
。5、基因工程只能生产自然界 蛋白质，而蛋白质工程则可以通过对 的修饰或改造 ，对现有的蛋白质进行改造
，或生产一种 的蛋白质。

蛋白质工程的基本途径是  。蛋白质工程具有诱人的前景，但是最大的困难是：日前科学家对大多数蛋白质的 了解还不够
。

答案：一 、1
、原核生物 识别特定的核苷酸序列 ，在特定切点切断磷酸二酯键2、大肠杆菌 黏性末端 T4噬菌体 黏性末端和平末端 恢复限制酶切断的磷酸二酯键3 、获取目的基因 构建基因表达载体 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 第1
、2、4 第2步4 、DNA双链复制原理 核苷酸序列 引物 四种游离的脱氧核苷酸 DNA两条母链 热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 加热至90-95度 指数 2n 5
、小型环状 限制酶切割位点 标记基因6、受体菌 基因组文库 部分基因文库 反转录 启动子和终止子7 、基因表达载体 同一种限制酶 黏性末端 DNA连接酶 脱氧核糖 磷酸 8
、农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 农杆菌转化法 基因枪法9、酚类 Ti T-DNA 10 、植物组织培养 受精卵 全能性 显微注射技术 表达载体 受精卵 胚胎早期培养 雌 输卵管或子宫 二、1
、DNA分子杂交技术 放射性同位素 探针 2、分子杂交技术 3 、抗原-抗体杂交技术 4
、个体三、1 、启动子 雌 受精卵 2。

2.高中生物选修三知识点总结

专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望
，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术 ，赋予生物以新的遗传特性
，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的
。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列 ，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端 。

2.“分子缝合针 ”——DNA连接酶 （1）两种DNA连接酶（E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键
。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端 ，但连接平末端的之间的效率较低。

（2）与DNA聚合酶作用的异同：?DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键 。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端
，形成磷酸二酯键
。

3.“分子运输车
”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入 。

③具有标记基因 ，供重组DNA的鉴定和选择
。 （2）最常用的载体是?质粒
，它是一种 *** 的
、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体： 噬菌体的衍生物 、动植物病毒 （二）基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因  。 2.原核基因采取直接分离获得 ，真核基因是人工合成
。

人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90~95℃DNA解链；第二步：冷却到55~60℃
，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70~75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成 。

第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在 ，并且可以遗传至下一代
，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端 ，是RNA聚合酶识别和结合的部位
，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质
。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段  ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 。

常用的标记基因是抗生素基因
。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内
，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等 。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术
。

此方法的受体细胞多是 受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快
、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 
，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞  ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合
，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程 。

3.重组细胞导入受体细胞后 ，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达
。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
，方法是采用 DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交 。 3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质 ，方法是从转基因生物中提取 蛋白质
，用相应的 抗体进行抗原-抗体杂交
。

4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状 。

（三）基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫 、抗病
、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质 、用转基因动物生产药物
。

3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内 ，使该基因表达产物发挥作用。 （四）蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成
，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质 ，以满足人类的生产和生活的需求 。

（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质） 转录 翻译 专题2 细胞工程 （一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性 全能性表达的难易程度：受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞；植物细胞>动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 ―→愈伤组织 ―→试管苗 ―→植物体 （2）用途：微型繁殖
、作物脱毒、制造人工种子 、单倍
。

3.高中生物选修3知识点归纳

选修3
、现代生物科技专题专题1、基因工程什么是基因工程？1.1DNA重组技术的基本工具一 、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）一来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

二功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性 。三结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式 ，黏性末端和平末端
。

二
、“分子缝合针 ”——DNA连接酶一功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。连接部位：磷酸二酯键
，不是氢键 。

二两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：⒈相同点：都缝合磷酸二酯键
。⒉区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端 ，但连接平末端的之间的效率较低。

三与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端
，形成磷酸二酯键 。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
。

三、“分子运输车
”——载体（与细胞膜上的载体有什么区别？）一作为载体的必要条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点 ，供外源DNA片段插入；具有标记基因
，供重组DNA的鉴定和选择；对受体细胞无害 、易分离。二最常用的载体是质粒：是一种 *** 的
、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子 。

三其它载体：噬菌体的衍生物 、动植物病毒。1.2基因工程的基本操作程序一
、目的基因的获取（什么是目的基因？）一获取方法：原核基因采取直接分离获得 ，真核基因是人工合成
。

二从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？三者间是什么关系？怎样从基因文库中获取目的基因？三利用PCR技术扩增目的基因⒈什么是PCR技术？⒉原理：DNA双链复制。⒊PCR技术需哪些必要条件？PCR的结果是什么？⒋过程：变性→退火→延伸→多次重复 。

四直接人工合成
。二、基因表达载体的构建（该过程实际上是不同来源的基因重组的过程，是基因工程的核心）一构建基因表达载体的目的是什么？怎样构建？二一个基因表达载体的组成：复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因什么是启动子 、终止子？它们分别在基因表达载体上的什么位置？各有什么作用？标记基因有什么作用？三、将目的基因导入受体细胞一转化的概念：是目的基因进入受体细胞内
，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

二常用的转化方法⒈将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等 。导入到了植物细胞的什么位置？⒉将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术
。

此方法的受体细胞多是受精卵。⒊将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的优点有哪些？最常用的原核细胞是什么？转化方法是什么？三重组DNA导入受体细胞后 ，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达 。

四
、目的基因的检测和表达一首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
。方法：DNA分子杂交技术。

该方法的原理是什么？二其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA 。方法：用标记的目的基因作探针与mRNA杂交
。

三最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。方法：从转基因生物中提取蛋白质
，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交 。

四有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状
。

1.3基因工程的应用一、植物基因工程：抗虫 、抗病
、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。二、动物基因工程：提高动物生长速度 、改善畜产品品质
、用转基因动物生产药物、作器官移植的供体 。

三 、基因工程药物：细胞因子
、抗体、疫苗 、激素等
。四
、基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内 ，使该基因表达产物发挥功能
，多而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。

1.4蛋白质工程的崛起一、天然蛋白质为什么不能完全适应生产和使用需要？实现蛋白质工程的基本途径是什么？二 、蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础 ，通过基因修饰或基因合成
，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质 ，以满足人类的生产和生活的需求 。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）专题2 、细胞工程什么是细胞工程？根据操作对象不同
，可分为哪几种？2.1.1植物细胞工程的基本技术一
、理论基础（原理）：细胞全能性
。

一什么是细胞的全能性？在生物生长发育过程中，细胞为什么不会表现出全能性？二全能性表达的难易程度：受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞；植物细胞>动物细胞。植物组织培养技术一过程什么是植物组织培养？什么叫脱分化？脱分化的实质是什么？（恢复细胞全能性的过程）脱分化的结果是什么？什么叫再分化？什么是愈伤组织 ，有什么特点？二地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序 。

三
。

4.人教版生物选修3知识点

必修三第一章：人体的内环境与稳态1 、体液：体内含有的大量以水为基础的物体。

细胞内液（2/3）体液 细胞外液（1/3）：包括：血浆
、淋巴、组织液等2 、体液之间关系： 血浆 细胞内液 组织液 淋巴3
、内环境：由细胞外液构成的液体环境 。内环境作用：是细胞与外界环境进行物质交换的媒介
。

4、组织液 、淋巴的成分和含量与血浆的相近，但又不完全相同
，最主要的差别在于血浆中含有较多的蛋白质，而组织液和淋巴中蛋白质含量较少5
、细胞外液的理化性质：渗透压、酸碱度 、温度。6
、血浆中酸碱度：7.35---7.45 调节的试剂：缓冲溶液： NaHCO3/H2CO3 Na2HPO4/ NaH2PO47、人体细胞外液正常的渗透压：770kPa 、正常的温度：37度8、稳态：正常机体通过调节作用 ，使各个器官
、系统协调活动、共同维持内环境的相对稳定的状态 。

内环境稳态指的是内环境的成分和理化性质都处于动态平衡中9 、稳态的调节：神经 体液 免疫共同调节内环境稳态的意义：内环境稳态是机体进行正常生命活动的必要条件第二章；动物和人体生命活动的调节1
、神经调节的基本方式：反射神经调节的结构基础：反射弧反射弧：感受器→传入神经（有神经节）→神经中枢→传出神经→效应器（还包括肌肉和腺体）神经纤维上 双向传导 静息时外正内负静息电位 → *** → 动作电位→ 电位差→局部电流 2、兴奋传导 神经元之间（突触传导） 单向传导 突触小泡（递质）→ 突触前膜→突触间隙→ 突触后膜（有受体）→产生兴奋或抑制3 、人体的神经中枢：下丘脑：体温调节中枢
、水平衡调节中枢、生物的节律行为脑干：呼吸中枢小脑：维持身体平衡的作用大脑：调节机体活动的最高级中枢脊髓：调节机体活动的低级中枢4 、大脑的高级功能：除了对外界的感知及控制机体的反射活动外
，还具有语言
、学习、记忆 、和思维等方面的高级功能。大脑S区受损会得运动性失语症：患者可以看懂文字
、听懂别人说话、但自己不会讲话5 、激素调节：由内分泌器官（或细胞）分泌的化学物质进行调节激素调节是体液调节的主要内容，体液调节还有CO2的调节6、人体正常血糖浓度；0.8—1.2g/L低于0.8 g/L：低血糖症 高于1.2 g/L；高血糖症
、严重时出现糖尿病
。

7、人体血糖的三个来源：食物 、肝糖原的分解
、非糖物质的转化 三个去处：氧化分解、合成肝糖原肌糖原 、转化成脂肪蛋白质等8
、血糖平衡的调节 血糖浓度升高 胰岛素 胰高血糖素（胰岛B细胞分泌） （胰岛A细胞分泌） 血糖浓度降低9、体温调节寒冷 *** 下丘脑 促甲状腺激素释放激素 垂体→促甲状腺激素甲状腺 甲状腺激素 促进细胞的新陈代谢甲状腺激素分泌过多又会反过来抑制下丘脑和垂体的作用 ，这就是反馈调节。人体寒冷时机体也会发生变化；全身发抖（骨骼肌手缩） 、起鸡皮疙的（毛细血管收缩）10
、激素调节的特点：微量和高效、通过体液运输（人体各个部位） 、作用于靶器官或靶细胞11
、神经调节与体液调节的区别比较项目神经调节体液调节作用途径反射弧体液运输反应速度迅速较缓慢作用范围准确、比较局限较广泛作用时间短暂比较长12 、水盐平衡调节 饮水不足 失水过多 食物过咸 ↓ 细胞外液渗透压升高 （-） ↓（+） （-） 下丘脑中的渗透压感受器 ↓ 垂体 ↓ ↓ 抗利尿激素 ↓（+） 肾小管 *** 管重吸收水 ↓ ↓（-）尿量减少13、神经调节与体液调节的关系：①：不少内分泌腺直接或间接地受到神经系统的调节②：内分泌腺所分泌的激素也可以影响神经系统的发育和功能例如：甲状腺激素成年人分泌过多：甲亢过少；甲状腺肿大（大脖子病） 婴儿时期分泌过少：呆小症 免疫器官（如：扁桃体
、淋巴结、骨髓 、胸腺
、脾等） 吞噬细胞14、免疫系统的组成 免疫细胞 T细胞（在胸腺中成熟） 淋巴细胞 B细胞（在骨髓中成熟） 免疫活性物质（如：抗体） 第一道防线：皮肤 、粘膜等 非特异性免疫（先天免疫）第二道防线：体液中杀菌物质（溶菌酶）
、吞噬细胞15、免疫 特异性免疫（获得性免疫） 第三道防线：体液免疫和细胞免疫 在特异性免疫中发挥免疫作用的主要是淋巴细胞16 、免疫系统的功能：防卫功能
、监控和清除功能17、抗原：能够引起机体产生特异性免疫反应的物质（如：细菌 、病毒
、人体中坏死、变异的细胞 、组织） 抗体：专门抗击抗原的蛋白质18、免疫分为；体液免疫（主要是B细胞起作用）
、细胞免疫（主要是T细胞起作用）19、体液免疫过程：（抗原没有进入细胞） 浆细胞 抗体 抗原 吞噬细胞 T细胞 B细胞 记忆B细胞记忆B细胞的作用：可以在抗原消失很长一段时间内保持对这种抗原的记忆
，当再接触这种抗原时，能迅速增殖和分化 ，产生浆细胞从而产生抗体 。

抗体与抗原结合产生细胞集团或沉淀
，最后被吞噬细胞吞噬消化20 、细胞免疫（抗原进入细胞） 记忆T细胞侵入细胞的抗原 T细胞 效应T细胞效应T细胞作用：使靶细胞裂解，抗原暴露暴露的抗原会被吞噬细胞吞噬消化 过敏反应：再次接受过敏原 21
、免疫失调引起的疾病 自身免疫疾病：类风湿、系统性红斑狼疮 免疫缺陷病：艾滋病22 、过敏反应的特点：发作迅速
、反应强烈、消退较快；一般不会破坏组织细胞 ，也不会引起组织严重损伤；有明显
。

基因表达载体的构建是什么?

专题1 基因工程

1.1 DNA重组技术的基本工具

1.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？

提示：迄今为止
，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA ，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉 。生物在长期演化过程中
，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列 ，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上
，使限制酶不能将其切开
。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 ，并且可以防止外源DNA的入侵。

2.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？

提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid）
，即独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制 、双链闭环的裸露的DNA分子 。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件
。

（1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点 ，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置
，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活 。

（2） 载体DNA必需具备自我复制的能力 ，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制
。

（3） 载体DNA必需带有标记基因
，以便重组后进行重组子的筛选。

（4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害 ，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 。

（5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作
，太大就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作
。

3.DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

提示：迄今为止 ，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力
，至于原因，现在还不清楚 ，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。

4.根据你所掌握的知识
，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？

提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是 ，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制
，以防止外来病原物的侵害 。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时 ，会利用限制酶将外源DNA切割掉
，以保证自身的安全
。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA
、使之失效 ，从而达到保护自身的目的。

5.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

不是一回事 。基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E?coli连接酶
。另一种是从T4噬菌体中分离得到
，称为T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口 ，而不能连接单链DNA 。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键
，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？

（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上 ，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键
。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板 。此外 ，二者虽然都是由蛋白质构成的酶
，但组成和性质各不相同
。

6.具备什么条件才能充当“分子运输车”？

提示：能自我复制、有一个或多个切割位点 、有标记基因位点及对受体细胞无害等。

7.（1）限制酶所识别的序列有什么特点？

限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基 ，都可以找到一条中心轴线
，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 。

（2）限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？

任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质所决定的。

（3）DNA连接酶连接的是什么部位？

DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键 ，而不是连接互补碱基之间的氢键
。

1.2 基因工程的基本操作程序

1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？

答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用
，还需要有其他控制元件，如启动子
、终止子和标记基因等 。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流 ，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子
，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件 ，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位
，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等
。

2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 ，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物
，如小麦，从理论上说 ，你应该如何做？

提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌
，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中，裸子植物对该菌也敏感 。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤
。根瘤农杆菌具有趋化性 ，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成
，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因 。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时 ，是需要加上述酚类物质的
，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异
。如果想将一个抗病毒基因转入小麦 ，也可以用农杆菌
，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质 ，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因
，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识 ，结合基因工程操作程序的基本思路
，思考一下，若要生产人的糖蛋白 ，可以用大肠杆菌吗？

提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的
，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器 ，因此
，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的 。

4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分
。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病 ，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法
，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想 ，应如何进行设计？

提示：基本操作如下：

（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA） 。

（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子
，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。

（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 ，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌
。如果表达载体未进入大肠杆菌中
，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。

（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌 ，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白 。

5.你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？

反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链
。像其他DNA聚合酶一样
，反转录酶也以5′→3′方向合成DNA（图1-3）。

cDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链 ，形成RNA-DNA杂交分子 。第二步
，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA
。第三步 ，以单链DNA为模板
，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

6.PCR的扩增过程是怎样的？

PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法 ，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法 。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程
。

第一步：将反应体系（包括双链模板、引物 、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃
，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA ，作为互补链聚合反应的模板。

第二步：将反应体系降温至55～60 ℃
，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性 。

第三步：将反应体系升温至70～75 ℃ ，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上
，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链
。

上述三步反应完成后 ，一个DNA分子就变成了两个DNA分子
，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的 。

7.什么是分子杂交技术的显示带？

分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术 ，主要用于检测和鉴定
，可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。常用的技术有：

Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交
。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点 ，就需要通过Southern杂交技术 。基本做法是：第一步
，将受体生物DNA提取出来，经过适当的酶切后 ，走琼脂糖凝胶电泳
，将不同大小的片段分开；第二步，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步 ，用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上
，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗 ，如果在底片上出现黑色条带
，则表明受体植物染色体DNA上有目的基因
。

Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交。它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法，具体做法与Southern杂交相同 ，只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA
，杂交带的显现也与Southern杂交相同 。

Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交
。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。

1.3 基因工程的应用

1.表1-1 转基因生物与目的基因的关系

转基因生物 目的基因 目的基因从何来

抗虫棉 Bt毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌

抗真菌立枯丝核菌的烟草 几丁质酶基因和抗毒素合成基因

抗盐碱和干旱作物 调节细胞渗透压的基因

耐寒的番茄 抗冻蛋白基因 鱼

抗除草剂大豆 抗除草剂基因

增强甜味的水果 降低乳糖的奶牛

甜味基因 肠乳糖酶基因

生产胰岛素的工程菌 人胰岛素基因 人

2.利用微生物生产药物的优越性何在?

所谓利用微生物生产蛋白质类药物，是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因 ，构建成表达载体后导入微生物
，然后利用微生物发酵来生产蛋白质类药物 。与传统的制药相比有以下优越性：（1）利用活细胞作为表达系统，表达效率高 ，无需大型装置和大面积厂房就可以生产出大量药品
。（2）可以解决传统制药中原料来源的不足。例如
，胰岛素是治疗糖尿病患者的药物，一名糖尿病患者每年需用的胰岛素需要从40头牛或50头猪的胰脏中才能提取到 。1978年科学家用2 000 L大肠杆菌发酵液得到100 g胰岛素 ，相当于从1 000 kg猪胰脏中提取的量
。又如，生长素是治疗侏儒症患者的药物
，治疗一名侏儒症患者每年需要从80具尸体的脑下垂体中提取生长素。利用基因工程菌发酵生产就不需要从动物或人体上获取原料 。（3）降低生产成本，减少生产人员和管理人员。

1.4 蛋白质工程的崛起

1.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？

答：基因工程是遵循中心法则 ，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能
，基本上是生产出自然界已有的蛋白质
。蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可以创造自然界不存在的蛋白质。

2.你知道酶工程吗？绝大多数酶都是蛋白质 ，酶工程与蛋白质工程有什么区别？

提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用
，借助工程学的手段，应用于生产
、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术 。概括地说 ，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的
。酶工程的应用主要集中于食品工业 、轻工业以及医药工业中。α-淀粉酶
、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉
，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等 。至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更是酶工程最直接的体现了
。通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂 ，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构
，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用 ，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造 。当然，随着蛋白质工程的发展
，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分
。

3.对天然蛋白质进行改造 ，应该直接对蛋白质分子进行操作
，还是通过对基因操作来实现？

毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的 ，改造了基因即对蛋白质进行了改造
，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功 ，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的 。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作
，难度要小得多
。

4.动物乳腺生物反应器？

1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白──tPA（组织型纤溶酶原激活物），展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为动物乳腺反应器 。

为什么要用动物乳腺作为反应器生产高价值的蛋白质产品呢？这是因为动物乳房是一种高度分化的专门化腺体 ，合成蛋白质的能力非常强
，尤其是一些经过长期的遗传改良，专门产奶的乳用动物品种 ，蛋白质合成能力更是惊人。一头优质奶牛，一年可产奶10 000 kg
。即便是一只奶山羊
，一年也可产奶2 000 kg。动物乳腺生物反应器归纳起来有四大优点：①产量高，且易收获目标产品 ，可以随乳汁分泌而排出动物体外；②目标产品的质量好 。动物乳腺组织不仅具有按遗传信息流向合成蛋白质的能力
，而且具备一整套对蛋白进行修饰和加工的能力，如糖基化 、羧化
、磷酸化以及分子组装等 ，而微生物和植物系统都不具备这种全面的蛋白质后加工能力；③产品成本低；④从奶牛中提取产品
，操作比较简单
。

基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建使目的基因能在受体细胞中稳定存在 ，并且可以遗传给下一代
，同时，使目的基因能够表达和发挥作用 。需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞的原因是基因表达载体包括复制原点、启动子 、终止子等结构 ，而目的基因没有
。

基因表达载体构建的目的

为了使目的基因在受体细胞中稳定存在
，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用；启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位 ，有了它才能驱动基因转录出mRNA，通过翻译过程
，最终获得所需要的蛋白质；终止子使转录在所需要的地方停止下来；标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

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