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4.打开某一个微信组.点击右上角.往下拉."消息免打扰"选项.勾选"关闭"(也就是要把"群消息的提示保持在开启"的状态.这样才能触系统发底层接口 。)
【央视新闻客户端】
设计引物加接头，扩增目的基因 ，连接到T载体上测序 。正确无误 ，切下来，酶切载体质粒与目的基因连接 ，阳性克隆鉴定 ，测序无误后构建完毕
载体构建
一．原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用 ，分别对目的基因和载体
DNA进行适当切割和修饰后 ，将二者连接在一起，再导入宿主细胞 ，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二．操作步骤
1． 摇菌
取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定） ，每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2． 提质粒
依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次） 。
3． 酶切
按下表加入试剂 。
反应所需试剂 体积（单位：ul）
质粒 10
所需内切酶反应缓冲液 2
所需限制性内切核酸酶 1
H2O 7
将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）
4． 电泳检测
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳 ，检测酶切是否成功 。
5． 连接
如果电泳检测酶切成功的话 ，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接 ，连接体系如下：
双蒸水 5μL
10×T4 DNA连接缓冲液 1μL
载体 2μL
酶切后的目的基因 1μL
T4DNA连接酶 1μL
总体积 10μL
置于温箱 ，12-16℃，保温8-16h
6． 转化
依照转化具体操作步骤做感受态 ，将上述连接产物进行转化实验 ，涂板培养，37℃ ，
12-16h 。
7． 单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出 ，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP ，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管） ，给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后 ，将挑好的菌摇4-5小时 ，至混浊即可。
（2）单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR ，然后将PCR产物跑电泳 ，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL ，加到3ml（有LB液体培养液 ，AMP+）试管中，过夜摇；第二天重摇 ，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序 ，并保种 。
注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落 ，有卫星斑的不挑 。
②别忘记往培养基中加AMP。
③用接种环挑菌后 ，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌 。
三．注意事项
1． 连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；
2． 在细胞转化时 ，冰浴和热激要严格控制好时间；
3． 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤 ，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控
制好连接温度 。
4．进行黏末端连接时 ，会产生一定数量的载体自身环化分子 ，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化 。
参考：
1. 刘进元 ，常智杰 ，赵广荣,等.分子生物学实验指导[M].北京:清华大学出版社，2002
2. 周俊宜.分子生物学基本技能和策略[M].北京：科学出版社 ，2003：117-120
3. 李海英 ，杨峰山，邵淑丽,等.现代分子生物学与基因工程[M].北京:化学工业出版社 ，2008:138-142
4. 朱旭芬.基因工程实验指导[M].北京：高等教育出版社 ，2006:134-139
基因工程制药的注意事项?
育种方法
1、杂交育种：用于有性生殖的生物，利用基因自由组合原理，周期长 。
（1）原理：基因重组（通过基因分离 、自由组合 ，分离出优良性状或使各种优良性状集中在一起。
（2）方法：连续自交 ，不断选种。
（3）举例：已知小麦的高秆（D）对矮秆（d）为显性，抗锈病(R)对易染底盘锈病(r)为显性 ，两对性状独立遗传 。现有高秆抗锈病 、矮秆易染病两纯系品种 。要求使用杂交育种的方法培育出具有优良性状的新品种。
操作方法：
①让纯种的高秆抗锈病和矮秆易染锈病小麦杂交得F1；
②让F1自交得F2
③选F2中矮秆抗病小麦自交得F3；
④留F3中未出现性状分离的矮秆抗病个体 ，对于F3中出现性状分离的再重复③④步骤 。
（4）特点：育种年限长，需连续自交不断举优汰劣才能选育出需要的类型 。
（5）说明：
①该方法常用于：
A．同一物种不同品种的个体间 ，如上例；
B．亲缘关系较近的不同物种个体间（为了使后代可育 ，应做染色体加倍处理，得到的个体即是异源多倍体） ，如八倍体小黑麦的培育、萝卜和甘蓝杂交。
②若该生物靠有性生殖繁殖后代 ，则必须选育出优良性状的纯种，以免后代发生性状分离；若该生物靠无性生殖产生后代 ，那么只要得到该优良性状就可以了 ，纯种、杂种并不影响后代性状的表达 。
2 、人工诱变育种
（1）原理：基因突变
（2）方法：用物理因素（如X射线 、r射线、紫外线 、激光等）或化学因素（如亚硝酸 、硫酸二乙脂等）来处理生物，使其在细胞分裂间期DNA复制时发生差错，从而引起基因突变 。
（3）举例：太空育种、青霉素高产菌株的获得
（4）特点：提高了突变率 ，创造人类需要的变异类型 ，从中选择培育出优良的生物品种，但由于突变的不定向性 ，因此该种育种方法具有盲目性。
（5）说明：该种方法常用于微生物育种 、农作物育种等 。
3 、单倍体育种：无性生殖（组织培养） ，利用花药离体培养，周期短 。
（1）原理：染色体变异
（2）方法：花药离休培养获得单倍体植株 ，再人工诱导染色体数目加倍。
（3）举例：已知小麦的高秆（D）对矮秆（d）为显性 ，抗锈病（R）对易染锈病（r）为显性，两对性状独立遗传 。现有高秆抗锈病、矮秆易染病两纯系品种 。要求用单倍体育种的方法培育出具有优良性状的新品种。
操作方法：
①让纯种的高秆抗锈病和矮秆易染锈病小麦杂交得F1；
②取F1的花药离体培养得到单倍体；
③用秋水仙素处理单倍体幼苗 ，使染色体加倍 ，选取具有矮秆抗病性状的个体即为所需类型。
（4）特点：由于得到的个体基因都是纯合的，自交后代不发生性状分离 ，所以相对于杂交育种来说 ，明显缩短了育种的年限 。
（5）说明：A该方法一般适用于植物 。
B该种育种方法有时须与杂交育种配合，其中的花药离休培养过程需要组织培养技术手段的支持。
4 、多倍体育种：果实肥厚，营养含量高 ，茎杆粗壮 。
（1）原理：染色体变异
（2）方法：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 ，从而使细胞内染色体数目加倍，染色体数目加倍的细胞继续进行正常的有丝分裂 ，即可发育成多倍体植株 。
（3）举例：
①三倍体无籽西瓜的培育（同源多倍体的培育）过程图解：参见高二必修教材第二岫图解说明：
A．三倍体西瓜种子种下去后 ，为什么要授以二倍体西瓜的花粉？
西瓜三倍体植株是由于差数分裂过程中联会紊乱，未形成正常生殖细胞 ，因而不能形成种子。但在三倍体植株上授以二倍体西瓜花粉后 ，花粉在柱头上萌发的过程中，将自身的色氨酸转变为吲哚乙酸的酶体系分泌到西瓜三倍体植株的子房中去 ，引起子房合成大量的生长素；其次 ，二倍体西瓜花粉本身的少量生长素，在授粉后也可扩散到子房中去 ，这两种来源的生长素均能使子房发育成果实（三倍体无籽西瓜） 。
B．如果用二倍体西瓜作母本 、四倍体西瓜作父本 ，即进行反交，则会使珠被发育形成的种皮厚硬，从而影响无籽西瓜的品质 。
②八倍体小黑麦的培育（异源多倍体的培育）：
普通小麦是六倍体（AABBDD） ，体细胞中含有42条染色体 ，属于小麦属：黑麦是二倍体（RR），体细胞中含有14条染色体 ，属于黑麦属。两个不同的属的特种一般是难以杂交的 ，但也有极少数的普通小麦品种含有可杂交基因，能接受黑麦的花粉 。杂交后的子一代含有四个染色体组（ABDR） ，不可育 ，必须用人工方法进行染色体加倍才能产生后代，染色体加倍后的个体细胞中含有八个染色体组（AABBDDRR） ，而这些染色体来自不同属的特种 ，所以称它为异源八倍体小黑麦 。
（4）特点：该种育种方法得到的植株茎秆粗壮，叶片、果实和种子较大 ，糖类和蛋白质等营养物质的含量有所增加。
（5）说明：①该种方法用于植物育种；②有时须与杂交育种配合 。
5 、基因工程：定向培育新物种
（1）原理：DNA重组技术（属于基因重组范畴）
（2）方法：按照人们的意愿 ，把一种生物的个别基因复制出来，加以修饰改造，放到另一种生物的细胞里 ，定向地改造生物的遗传性状 。操作步骤包括：提取目的基因 、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达等
（3）举例：能分泌人类胰岛素的大肠杆菌菌株的获利 ，抗虫棉，转基因动物等
（4）特点：目的性强 ，育种周期短。
（5）说明：对于微生物来说 ，该项技术须与发酵工程密切配合，才能获得人类所需要的产物。
6 、利用“细胞工程 ”育种：
原理 植物体细胞杂交 细胞核移植
方法 用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞 ，并且把杂种细胞培育成新植物体的方法 。操作步骤包括：用酶解法去掉细胞壁 、用诱导剂诱导原生质体融合、将杂种细胞进行组织培养等 是把一生物的细胞核移植到另一生物的去核卵细胞中 ，再把该细胞培育成一个的生物个体 。操作步骤包括：吸取细胞核 、将移植到去核卵细胞中 、培育（可能要使用胚胎移植技术）等。
举例 “番茄马铃薯 ”杂种植株 鲤鲫移核鱼，克隆动物等
特点 可克服远缘杂交不亲合的障碍 ，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围 。
说明 该种方法须植物组织培养等技术手段的支持 。
7、利用植物激素培育特定性状
（1）原理：适宜浓度的生长素可以促进果实的发育
（2）方法：在未受粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物溶液 ，子房就可以发育成无籽果实。
（3）举例：无籽番茄的培育
（4）特点：由于生长素所起的作用是促进果实的发育，并不能导致植物的基因型的改变 ，所以该种变异类型是不遗传的 。
（5）说明：该种方法适用于植物 。且不属于育种方式 ，只改变性状，并未改变遗传物质。
太广了，我也只能就我知道和想到的回答一些 。
1 、采用发酵法的话 ，不能在生产过程中添加抗生素 。
2 、对于菌种的毒性试验 ，当然应该完成，应该采用去毒菌种。
3、在产品的微生物限度检测中 ，应该加入生产菌这一项 。
4 、菌种当然应该是稳定性好的菌种 。
你可以看下这本书《中国基因工程制药行业研究报告》。
关于“真菌表达载体怎么构建？”这个话题的介绍 ，今天小编就给大家分享完了，如果对你有所帮助请保持对本站的关注！
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