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作者单位:215003江苏省苏州大学附属儿童医院中心实验室
综述?基因敲除的新技术———RNAi
金美芳综述 朱雪明审校
摘要 RNA干扰(RNAi)是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分予介导,特异降解
相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,自1995年首次报道以来已取得了重大研究进展。近8年来,研究者对RNAi现象进行了广泛 、深入的探索研究,预示RNAi有望成为今后分析人类基因功能的有力工具,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用。
关键词 RNA干扰; 基因敲除; 基因沉默中图分类号:R457.4文献标识码:A文章编号:167324130(2007)1121016204
基因敲除是一种反向的遗传学研究方法,是八十年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术 。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,但此技术较复杂且成功率不高 。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA干扰(RNAinterference,RNAi),它们同样可以达到基因敲除的目的。其中RNAi由于方法简便,周期较短,因此近几年来越来越多的基因敲除采用了RNAi方法[1～3] 。RNAi是指双链RNA诱导同源mRNA降解导致基因表达抑制的现象,又称基因沉默.是一种转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制 。
RNAi现象的发现
1995年,Ouo等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par21基因的表达,该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年,Fire等证实Guo等发现正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量内源或外源双链RNA(double2strandedRNA,dsRNA),而引发并将这一现象命名为RNAi 。此后dsRNA介导的RNAi现
象陆续发现于真菌、果蝇 、拟南芥 、锥虫、水螅 、涡虫 、斑马壁等多种真核生物中,并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性 、真菌的抑带(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式 。
RNAi阻断基因表达的机理
双链RNA进入细胞后,能够在Dicer酶的作用
下被裂解成小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),而另一方面双链RNA还能在RdRP(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA2di2rectedRNApotyraerase,RdRP)的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链,并与某些蛋白形成复合物,Argonaute2是目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白 。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以siRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链 。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siR2NA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚台酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制 。从21～23个核昔酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA 。
RNAi基因敲除的优点
1.比同源重组法更加简便,周期大大缩短。
2.对于哺乳动物,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。
3.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达,它
成为研究信号传导通路的良好工具 。
4.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用 。
siRNAs的制备方法
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包
括:化学合成 、体外转录、长片段dsRNAs经RNaseⅢ
类降解(如Dicer,E.coli,RNaseⅢ)、siRNA表达载体
或病毒载体在细胞中表达siRNAs 、PCR制备的siRNA
美国科学家马里奥·卡佩基 、奥利弗·史密斯和英国科学家马丁·埃文斯这3位获奖科学家，利用“基因靶向”技术让小鼠体内的特定基因失去活性 ，培养出研究价值极高的“基因敲除”小鼠。英国著名科普杂志《新科学家》网站8日推出特别报道指出 ，“基因靶向 ”技术的重要性是使任意改变小鼠基因变为现实 。其为人类遗传病研究提供了药物试验的动物模型 。有了这些动物模型后，人类就能更有效地找到治疗各种遗传病的新疗法 ，彻底攻克遗传病就为时不远了。
在现代医学领域 ，用“为害甚重 ”来形容那些让科学家们头疼不已的遗传病再贴切不过了 。这些疾病是由致病基因引起的，如先天性心脏病、血友病 、囊肿性纤维化等 。由于基因疗法还不够成熟 ，一旦患上了遗传病就只能“听天由命”了。但人们一直尝试找出这些基因以“对症下药 ” ，寻找这些基因的科学家就是不折不扣的狙击手 。由于组成生命的基本体——脱氧核糖核酸（DNA）分子很小，致病基因更是深藏不露，科学家们要找到它很难 ，这时“基因瞄准镜 ”——“基因靶向”技术就派上了用场 。 “基因靶向 ”技术 ，指利用DNA可与外源性DNA发生同源重组的性质，定向改造生物体的某一基因。有了这一强大武器 ，人们就可以瞄准某一特定基因 ，使其失去活性，进而研究该特定基因的功能 。打个比方 ，使用“基因靶向 ”这具“高精度瞄准镜” ，科学家们就能精确瞄准任何一个基因，并对它进行深入研究 。
虽然“基因靶向 ”技术如今广受重视 ，但它起步比较晚 ，20世纪80年代初才发展起来。1981年，时任英国卡的夫大学哺乳动物基因学教授的英国科学家马丁·埃文斯 ，首次从老鼠胚胎中提取出胚胎干细胞（ESC） ，当时他还未意识到这对人类遗传病研究的重大意义。胚胎干细胞指的是在人胚胎发育早期未分化的细胞，具有细胞全能性，可以分化 、发育成完整的动物个体 。美国科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯 ，在获悉埃文斯的研究成果后如获至宝 ，他们有了全新的想法——对胚胎干细胞进行基因改造，这就导致了“基因敲除 ”小鼠的出现 。
科学家们设想 ，让生物体内一部分不活跃 、功能未知的基因“沉默” ，以找出遗传病的罪魁祸首。这一点其实也不难理解，英国科学家埃文斯就曾用一个生动的例子形容这个过程：一个乐团正在演出 ，却混进了一个技艺不精的滥竽充数者 。他的出现使得乐团的整体表现严重下降 。怎样将他揪出来呢？最好的办法是 ，让“生面孔 ”停止演出，如果演出质量没有多大变化 ，那么他就不是要找的那个人。如果演出能恢复到先前的水平 ，那么被揪出的那个人就是问题的根源 。对科学家们来说，人体就像一个乐团 ，致病基因的出现打乱了正常秩序 ，需要找到应对之策 。
随着“基因靶向 ”技术的日渐成熟，科学家能成功地将小鼠体内的某些基因“敲除”，这就是后来的“基因敲除”小鼠。具体做法是 ，先通过基因重组的办法 ，对小鼠胚胎干细胞进行基因修饰——将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然后将“修饰 ”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎 ，生成嵌合体小鼠 。这种小鼠长大后 ，体内部分细胞内存在被修饰过的DNA片段，而一些可疑基因已经被“敲 ”掉了 。如果“敲掉”小鼠生殖细胞里的目标基因 ，则出生后的小鼠体内所有的细胞都是被“修饰 ”过的。
1989年 ，科学们培育出了首只“基因敲除 ”小鼠，他们通过多次“敲” ，在小鼠体内发现了导致莱一二氏症（又称自毁容貌综合症 ，属X－连锁隐性遗传）的基因 。迄今为止，科学家们已培育了500多种存在不同基因变异的小鼠 ，总数超过一万只 ，这些变异小鼠对应的人类疾病包括心血管疾病 、糖尿病和癌症等 。
这些小鼠对医学研究的价值颇大，正如以小鼠医学研究闻名的美国杰克逊实验室主管里查德·沃伊基克所说的：“这些用于研究基因的小鼠，对我们的研究方法产生了革命性的影响 ，现在人们一遇到新基因 ，就想到了‘基因敲除’小鼠。 ”世界上很多大型研究机构都培育了“基因敲除 ”小鼠，其家族已发展到数千个品系。这说明 ，越来越多的病根被“敲”出来了 。
在众多科研人员的努力下 ，“基因靶向 ”技术也发展到了相当成熟的地步，科学家们已能让基因突变在小鼠生长的特定时间、特定细胞或器官内发生 。这就好像狙击手占据绝对主动的地位 ，能在合适的时候对目标发起致命一击。英国科学家埃文斯发展了自己先前的研究成果 ，和合作者成功地将人类遗传性肺病 、囊肿性纤维化基因移植到了小鼠身上 。史密斯领导的研究小组让高血压 、动脉疾病基因在小鼠体内得到了表达 。
美国《纽约时报》分析指出，“基因靶向 ”技术对人类治疗遗传病起到了至关重要的作用。该报援引一位资深研究人士的话说 ，小鼠基因系列与人类相似度达95% ，两者的器官也几乎一致，小鼠就相当于“口袋大小的袖珍人” 。
以人类囊肿性纤维化病为例 ，该病属单基因遗传病 ，目前仍属“不治之症 ” 。但科学家们培育出了患囊肿性纤维化病的小鼠，为针对这一疾病治疗研究提供了动物模型。有了这种小鼠，科学家们就可以大胆试用各种新疗法 ，攻克该病的可能性大大增加 。 科学家们在进行工程学、材料物理研究中 ，经常用计算机模型进行研究，与此类似 ，“基因敲除 ”小鼠成了活生生的“生物计算机” 。它提供了人类遗传病研究的理想模型 ，在阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用。有了这种“计算机”，人类就很有可能顺理成章地得到“运行结果 ”——有效的新疗法 。
胚胎干细胞研究终于获得了世界最高科学奖的肯定 ，这让科学家们看到了希望 。由于提取人类胚胎干细胞需要破坏早期胚胎 ，很多人权组织及宗教团体极力反对。美国政府也在重重压力之下减少了这一领域的科研经费，美国总统布什曾多次对干细胞法案说“不 ”。美国人类基因研究所的研究人员利勒·阿姆斯特朗乐观地表示：“或许布什总统不会改变决定 ，但未来联邦政府也许为胚胎干细胞研究设立专项基金 。”
关于“基因敲除和RNAi的异同点 ”这个话题的介绍 ，今天小编就给大家分享完了，如果对你有所帮助请保持对本站的关注！
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